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      单克隆抗体的作用机制及其体外功能实验(下)

      2018-09-21

      作者:吕晓芬博士   伍小春(小C)

      单克隆抗体的作用机制及其体外功能实验(下)


      体外单抗的生物功能实验能准确的评估一个抗体的效应功能,它是前期抗体研发阶段抗体的筛选和临床前抗体功能的进一步验证以及验证生物类似药与原研药的效价比较的一系列重要方法。

      下面介绍CDC和吞噬作用的机制和方法操作原理。
      另ADCC作用的机制和方法请见《单克隆抗体的作用机制及其体外功能实验(上)》分享。


      CDC 

      CDC是另外一个依赖于抗体介导的细胞杀伤作用。它的作用需要经典的补体激活途径激活补体。这是个级联过程。当抗原抗体结合后,补体分子C1q与IgG的CH2区域结合,由于抗原抗体的复合物使C1q与IgG由低亲和力转向高亲和力,进而激活涉及一系列补体蛋白的级联过程,继而形成膜攻击复合物(MAC),在细胞膜上产生小孔,促进水和溶质自由进出细胞,导致细胞裂解死亡。


      抗体能在体内发挥功效CDC也起一定的作用。但是CDC在体内抗肿瘤特性的作用尚不清楚,有可能更多取决于肿瘤靶标而不是抗体。这些抗肿瘤的抗体在体内发挥CDC作用取决与靶细胞表面抗原的表达量或者细胞表面某一部分的抗原密度。激活C1q需要高密度的与靶细胞表面抗原结合的抗体。肿瘤细胞表面经常高表达一些补体抑制剂如CD46,CD55和CD59,这些分子能够保护靶细胞免受补体介导的杀伤作用。因此,以上这些因素导致许多IgG1的抗体只发挥非常弱的CDC作用。


      与ADCC检测实验相比,CDC体外检测相对简单,先把靶细胞稀释至特定密度,加至96孔板中,然后加入梯度稀释好的抗体于37°孵育10-30min,然后加入补体于37°孵育1-24h。由于一些补体蛋白具有种属特异性,所以我们研究人的靶点以及其对应的嵌合抗体和人源化或是全人的抗体时,我们必须用人的血清。即使在前期的快速筛选抗体阶段会用到兔血清,但对于临床有参考意义的数据还是需要人的血清。小鼠的血清在CDC实验中杀伤靶细胞的效果很差而且鼠血清本身对靶细胞的毒性相当大。这就导致实验结果分析时难以分辨是否是抗体介导的杀伤。因而用鼠血清做补体的CDC数据相对少。实验中,有不同的方法测量靶细胞的裂解。最常用的是用非渗膜的荧光染料PI (propidium iodide),它能结合已裂解细胞的DNA,但是不能穿透正常细胞的细胞膜,通过流式检测CDC作用。或者检测LDH(乳酸脱氢酶)的释放,或者calcein AM标记靶细胞,然后测Calcein AM的释放(以上都是通过测死细胞来检测CDC作用),也可以通过测ATP的量来检测活细胞数来检测CDC作用。


      通过对ATP 进行定量测定来检测培养物中活细胞数目是一种均质快速的检测CDC结果的方法。ATP 是活细胞新陈代谢的一个指标。均质的“加样- 混合- 检测”操作方案使得细胞裂解和产生的发光信号与存在的ATP 量成正比,而ATP量直接与培养物中的细胞数量成正比。结果见图12



      图12: 通过测ATP的量检测CDC效应


      Phagocytosis assay

      小鼠体内进行的大多数据表明IgG抗体在体内发挥功能很大一部分依赖于巨噬细胞以及其表面表达的FcrRs。因此准确理解吞噬作用的原理和操作方法是抗体体外活性检测的重要部分。吞噬作用从原理上理解包括两种一种是抗体的Fab段与靶细胞上的靶点结合,Fc 段与巨噬细胞上的FcrRs结合,进而发生ADCP作用(见图1);另一种是CD47抗体介导的吞噬作用,CD47是免疫球蛋白超家族成员。CD47是细胞表面一个重要的"self"标记,是调节巨噬细胞吞噬作用的一个重要信号。CD47可以与巨噬细胞表面SIRPα结合,磷酸化其ITIM,随后招募SHP-1蛋白,产生一系列的级联反应抑制巨噬细胞的吞噬作用。研究表明,几乎所有的肿瘤细胞和组织都高表达CD47,是对应正常细胞和组织的3倍。通过CD47这个"self"信号,肿瘤细胞有效的躲避了巨噬细胞的吞噬作用。通过CD47抗体block这个"别吃我"的信号,使巨噬细胞发挥吞噬作用。图13


      图13: 阻断CD47使巨噬细胞发挥吞噬作用


      吞噬作用的测定一定程度上与ADCC相似,因为他们都依赖于共孵育的两种细胞。靶细胞与效应细胞(主要是巨噬细胞)孵育1-4小时,但有些情况需要孵育更长时间。还有巨噬细胞是贴壁细胞,所以孵育完后需要消化用流式细胞仪检测。而巨噬细胞是由新鲜的 PBMC加入一定量的HM-CSF诱导分化4-7天得到。检测方法主要有显微镜技术或流式细胞术的方法。由于显微镜的技术操作比较费力而且结果分析容易受到主观影响所以一般选用流式细胞术,此方法快速和并且容易定量。流式细胞法检测结果见图14和图15



      图14 吞噬作用流式图

      Q1:未发生吞噬的巨噬细胞;
      Q2:发生吞噬的巨噬细胞和靶细胞(双阳)
      Q3:被标记的靶细胞;     
      Q4: 未被标记的靶细胞


       图15: CD47 抗体介导的吞噬作用


      随着抗体类药物的快速发展,单抗的体外功能实验(ADCC和CDC和吞噬作用)发挥越来越重要的作用。他们不仅可以给抗体研发早期-抗体筛选阶段,抗体改造阶段提供重要的指导作用和参考价值,也可检测制品的批间一致性,从而间接反映生产过程的稳定性,可保证每批制品应用于人体的安全性和有效性。

      参考文献

      1.  M.A. Gillissen , E.Yasuda, G. de Jong, S.E. Levie, D. Go, H. Spits, P.M.vanHelden,M.D. Hazenberg ,The modified FACS calcein AM retention assay: A high throughput flow cytometer based method to measure cytotoxicity,J. Immunol. Methods (2016)

      2.  Josée Golay, Martino Introna,Mechanism of action of therapeutic monoclonal antibodies: Promises and pitfalls of in vitro and in vivo assays,Archives of Biochemistry and Biophysics 526 (2012) 146–153

      3.Automated Non-Radioactive Assay Methods For ADCC and CDC Assays,BioTek Instruments

      4.  Xin Wang, Zhiqiang An, Wenxin Luo, Ningshao Xia Qinjian Zhao,Molecular and  functional analysis of monoclonal antibodies in support of biologics development Protein Cell,DOI 10.1007/s13238-017-0447-x

      5.  Gregory P Adams & Louis M Weiner,Monoclonal antibody therapy of cancer Nature Biotechnology, 23(9), 1147–1157. doi:10.1038/nbt1137




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